MTT检测

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MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为huo 细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲ji亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联***检测仪在540 或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映huo 细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿 liuy***筛选、细胞毒性试验以及肿 liu***敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
贴壁细胞
1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的***,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若***与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5、终止培养，小心吸去孔内培养液。
6、每孔加入150ul二甲ji亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联***检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲ji亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的***溶解介质、培养液、MTT、二甲ji亚砜）
悬浮细胞
1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1?106/ml，按次序将①补足的1640（无血qing）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 l?g/ml，需预试寻找稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5?104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100?(储存液100 1640）。
2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联***检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲ji亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联***检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲ji亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的***溶解介质、培养液、MTT、二