蛋白质印迹法

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蛋白质印迹法(***印迹试验)即Western 
Blot。它是分子生物学、生物化学和***遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗ti对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
1.单层贴壁细胞总蛋白的提取:
(1)倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。
(2)每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0.01M 
pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
(3)按1ml裂解液加10 μl PMSF(100mM)，摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)
(4 )每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
(5 )裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)
(6 )于4℃下12000rpm离心5min。(提前开离心机预冷)
(7 )将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于-20℃保存。
2. 组织中总蛋白的提取:
(1 )将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
(2)加400 μL单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
(3 )几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
(4) 裂解30 
min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
3. 加***处理的贴壁细胞总蛋白的提取:
由于受***的影响，一些细胞脱落下来，所以除按(一)操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取:
(1 )将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
(2 )弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
(3)用枪洗干上清后，加100 μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
(4)将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。